VIGILANCIA Y DIAGNÓSTICO DE LA EQUINOCOCOSIS CANINA
Por estudios de material fecal fresca recolectada del medio ambiente y analizadas por microscopía óptica (MO)
A. VIGILANCIA Y DIAGNÓSTICO DE LA EQUINOCOCOSIS CANINA
- 1. Diagnóstico inicial
Al inicio de un programa de control es necesario contar con un diagnóstico del estado actual de la prevalencia y de su distribución geográfica.
Este diagnóstico se realiza mediante muestreos estadísticamente representativos de la población canina existente en cada región.
Los estudios de prevalencia de equinococosis canina deben iniciarse en las áreas identificadas como prioritarias por su alto riesgo para el ser humano, es decir, donde se detectan niños con hidatidosis quística. Luego, se extenderán a otras áreas donde el riesgo sea menor.
La prevalencia de la equinococosis canina se determinará en función de los medios, técnicas y equipos disponibles.
Podemos realizar un diagnóstico etiológico directo, mediante la aplicación del test con bromhidrato de arecolina para la identificación de parásitos adultos.
También podemos realizar un diagnóstico indirecto, a través de muestras de sangre (detección de anticuerpos) o de materia fecal canina y/o ambiental (identificación de huevos, antígenos o ADN de E. granulosus).
Las cifras obtenidas podrán ajustarse según la sensibilidad y especificidad de cada método, a fin de lograr una estimación más cercana a la verdadera prevalencia poblacional.
Las técnicas basadas en el estudio de la materia fecal permiten, al inicio del programa de control, recolectar, fraccionar y conservar las muestras para analizarlas posteriormente, cuando las condiciones técnicas estén disponibles.
1.2 Diagnóstico etiológico indirecto
El diagnóstico etiológico indirecto puede realizarse mediante el análisis de sangre y/o materia fecal.
Todos los métodos implican la toma de muestra, su registro y traslado al laboratorio para su análisis, por lo que suele haber cierta demora en la obtención y entrega de resultados.
- a. Estudios de materia fecal
Para un diagnóstico individual, las muestras pueden obtenerse:
- Por extracción desde la ampolla rectal (hisopado rectal o perianal).
- Por recolección de materia fecal fresca, emitida recientemente por perros que permanecen atados o en caniles individuales.
- Durante una necropsia o luego de la realización del test de arecolina.
También pueden tomarse muestras ambientales, recolectando materia fecal fresca o seca del suelo, así como tierra, agua o vegetales.
Son de importancia epidemiológica las muestras obtenidas en lugares donde permanecen los perros (quintas, huertas, patios de viviendas, plazas, areneros, etc.), ya que permiten obtener un diagnóstico de áreas o establecimientos infectados.
Existen diversas técnicas para el análisis de materia fecal, con diferente nivel de complejidad en su procesamiento y lectura.
La disponibilidad de freezers de –20 °C permite conservar las muestras por largo tiempo y analizarlas sin riesgo para el técnico, al inactivar los huevos de E. granulosus.
a.1 Diagnóstico por microscopía óptica (MO)
Método simple y de bajo costo, basado en la observación al microscopio óptico utilizando técnicas de enriquecimiento de huevos.
Puede aplicarse en laboratorios de baja complejidad, aunque, pese a su sencillez, se utiliza poco.
Su sensibilidad es limitada, dependiendo de la técnica de concentración empleada.
La detección de huevos en materia fecal no es sencilla, ya que el útero de las tenias no siempre libera huevos a la luz intestinal, pudiendo presentarse un número elevado de falsos negativos. El hisopado anal mejora la posibilidad de detección.
En caso de hallarse huevos de tenias, la especificidad es limitada al nivel de género, dado que la mayoría son morfológicamente similares.
Sí es posible diferenciar los huevos de Diphyllobothrium latum y Dipylidium caninum.
En áreas endémicas de hidatidosis, la detección de huevos de tenias puede corresponder a E. granulosus o a T. hydatigena (no zoonótica). En ambos casos, indica conductas de riesgo, como la alimentación de perros con vísceras crudas o la falta de dosificación con tenicidas (praziquantel u otros).
Por lo tanto, la observación microscópica constituye un indicador indirecto de riesgo de transmisión de hidatidosis para la población, especialmente los niños, en los lugares donde se estudian los perros.
1.3 Tenias posibles de encontrar en el perro
En el intestino del perro pueden hallarse distintas especies de tenias adultas.
Es fundamental conocer cuáles están presentes en la zona de estudio y sus ciclos biológicos, para interpretar correctamente los resultados epidemiológicos.
- a) Un perro puede ingerir un quiste hidatídico (presente en hígado o pulmones de ganado) y desarrollar granulosus.
- b) Puede ingerir un Cysticercus tenuicollis (en omento, mesenterio o bazo de ovinos/caprinos) y desarrollar hydatigena.
- c) Puede ingerir un Cysticercus ovis (en corazón, diafragma o músculos de ovinos) y desarrollar ovis.
- d) Puede ingerir un Coenurus cerebralis (en cerebro de ovinos) y desarrollar multiceps.
e) Puede ingerir una liebre, conejo o roedor y desarrollar T. pisiformis, T. serialis o T. taeniaeformis. - f) Puede ingerir peces parasitados (salmón o trucha) y desarrollar Diphyllobothrium latum (tenia ancha).
- g) Puede ingerir una pulga con cisticercoide y desarrollar Dipylidium caninum.
1.4 Tenias presentes en áreas rurales de zona de riesgo en Argentina
Los equipos de diagnóstico de los Programas de Control de Hidatidosis han determinado mayoritariamente la presencia de:
E. granulosus
T. hydatigena
B. PROTOCOLO PARA LA RECOLECCIÓN DE MUESTRAS
- Recolección de heces del ambiente
Comenzar la búsqueda por el lugar donde atan o duermen los perros.
Para colectar muestras recientemente emitidas, si es posible, indicar al productor que el día anterior ate los perros y los suelte recién cuando se inicie la recolección.
Lo más difícil es encontrar las muestras. Si las encontrás, levantá la muestra.
Identificar los colectores con número correlativo, usando marcador indeleble, tanto en la pared como en la tapa del frasco.
Recolectar materia fecal canina del ambiente, recientemente emitida (líquida, sólida o semisólida), evitando en lo posible la contaminación con tierra o pasto. Utilizar cuchara descartable hasta completar la mitad del frasco colector, sin adicionar ningún conservante.
Cerrar bien el colector, colocarlo en la palma de la mano, envolverlo con el guante utilizado y anudarlo. Numerar sobre el guante y colocar el frasco en la heladera portátil, manteniendo la menor temperatura posible.
Se llevará una planilla con los datos de cada muestra: número correlativo, fecha, tipo de muestra (líquida, sólida o semisólida), lugar de toma y datos de la unidad epidemiológica.
También se registrarán las coordenadas de cada unidad y el nombre del recolector.
Las muestras se colocarán en la conservadora de transporte, que será una conservadora de telgopor de 10–12 litros, de alta densidad, con tapa hermética y 2 acumuladores de frío, o una heladera conservadora eléctrica a 12 voltios, con manija, para su traslado al laboratorio.
Deben mantenerse refrigeradas a la menor temperatura disponible.
La conservación en frío evita o interrumpe la actividad enzimática de la materia fecal, que podría degradar el ADN parasitario.
- Unidad epidemiológica a muestrear
En cada comunidad a muestrear, se tomarán muestras en los siguientes ambientes epidemiológicos:
- Casa (corral – puesto) del poblador.
Si el lugar de faena o la huerta están alejados de la vivienda, se considerarán otras unidades epidemiológicas.
- a.1. Lugar de faena
- a.2. Quinta o huerta
- Instituciones.
Puesto sanitario, club, junta vecinal, policía, escuela, etc.
En las escuelas se priorizará el lugar de juego de los niños.
- Número de muestras
Se recolectarán hasta 4 muestras por unidad epidemiológica, dentro de un perímetro no mayor a 100 pasos (aproximadamente 70 metros).
- Lugares a muestrear y número estimado
- a. xxx. XX muestras
- b.
Estimar el número de lugares y número de muestras a recolectar.
- Planilla de registro
La planilla de registro será en formato papel, para luego volcar los datos en una planilla Excel en el laboratorio.
Deberá incluir: número correlativo, fecha, lugar, unidad epidemiológica, tipo de muestra, datos de la vivienda del poblador, institución, lugar de faena y huerta.
Si es posible, registrar las coordenadas geográficas de cada unidad.
La planilla Excel deberá consignar, además:
- Fecha de ingreso de la muestra al freezer.
- Fecha en que se separaron las cinco alícuotas.
- Resultado de cada muestra y lugar de su análisis.
También se registrará quién tomó la muestra y quién la analizó.
- Acondicionamiento en laboratorio
En el laboratorio, las muestras serán colocadas en un freezer a –20 °C durante al menos dos semanas antes del procesamiento, con el objetivo de trabajar con material biológico seguro.
Transcurrido ese período, y aplicando las medidas de bioseguridad correspondientes, se homogeneizarán las muestras y se fraccionarán en cinco alícuotas, conservadas en crioviales.
La homogeneización y el filtrado se realizan con agua destilada. Si la muestra está muy compacta o seca, se puede utilizar una mezcla 1:1 de agua destilada y solución fisiológica (NaCl 0,9 %), lo que mantiene la osmolaridad sin afectar los huevos parasitarios.
Este procedimiento permite obtener una suspensión uniforme y limpia, sin alterar la morfología ni la densidad necesarias para los métodos de concentración posteriores.
Para la homogenización se emplea una pequeña cantidad de agua destilada (5–10 mL por gramo de materia fecal) a fin de facilitar la trituración en el mortero.
La suspensión obtenida se filtra con gasa doble o colador de malla fina (0,5 mm) para eliminar restos gruesos (fibra, pasto, tierra, huesillos, etc.) y se transfiere a un tubo cónico de 50 mL o vaso de precipitados limpio.
El homogenizado filtrado se reparte luego en crioviales, que se conservarán en el freezer hasta su transporte y procesamiento.
Distribución de alícuotas
- Método de Willis: En crioviales de 5 mL, llenar con ≈ 4 mL de homogenizado (dejando 1 mL de cámara de expansión para evitar fisuras por congelación).
- Método Telemann: En crioviales de 5 mL, llenar con ≈ 4 mL de homogenizado.
- Método Ritchie: En crioviales de 5 mL, colocar 3,8 mL de la suspensión homogenizada y agregar 0,8 mL de formol al 10 % (preparado diluyendo formol comercial 37–40 % en una proporción 1:9 con agua destilada).
- Copro-LAMP: En crioviales de 2 mL, colocar 0,5 mL de homogenizado fecal y 1,5 mL de etanol 70 %.
- Copro-PCR: En crioviales de 2 mL, colocar 0,5 mL de homogenizado fecal y 1,5 mL de etanol 70 %.
Preparación de etanol 70 %: para 100 mL, mezclar 73 mL de alcohol 96 % con 27 mL de agua destilada.
Las alícuotas conservadas en alcohol destinadas a LAMP y PCR se utilizarán únicamente con las muestras positivas a huevos de Taenia spp., en caso de disponer de los recursos necesarios para su procesamiento molecular.
- Materiales para Diagnóstico Coproparasitológico
- Ver planilla Excel
- Toma de Muestras en Campo
- C. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE MATERIA FECAL POR MICROSCOPÍA ÓPTICA (MO)
Las muestras serán analizadas mediante tres técnicas de sedimentación y flotación, con el objetivo de realizar la búsqueda microscópica de huevos de Taenia spp. caninas, entre los que se encuentran Echinococcus granulosus y Taenia hydatigena.
Adicionalmente, estos métodos permiten detectar huevos de Toxocara spp. y Ancylostoma spp., agentes causales de los síndromes Larva migrans visceral y Larva migrans cutánea, ambos de importancia médica.
El propósito de estas técnicas es concentrar en un pequeño volumen los elementos parasitarios presentes en la muestra, facilitando su observación al microscopio.
Los huevos de la Taenias
Esféricos o elipsoidales y mide entre 30 a 50 micras
Capa externa (embrióforo): formada por bloques de queratina
Oncósfera: presenta células glandulares, musculares y germinales que posee tres pares de ganchos.
Las técnicas de flotación emplean soluciones de alta densidad que permiten que los huevos y otras estructuras parasitarias floten en su superficie; en este trabajo se aplicará el método de Willis.
Por su parte, los métodos de sedimentación buscan reunir los elementos parasitarios en un sedimento reducido, mediante centrifugación y el uso de solventes de baja gravedad específica, como éter o acetato de etilo; en este caso se aplicarán los métodos de Telemann y de Ritchie.
Estas técnicas son las utilizadas rutinariamente para el diagnóstico de parasitosis intestinales, tanto en el ámbito de la salud humana como animal.
Se trata de métodos de bajo costo, posibles de realizar en laboratorios de baja complejidad, aunque presentan baja sensibilidad y cierta dificultad para identificar específicamente los huevos de spp.
Los resultados obtenidos mediante estas metodologías —que permiten identificar huevos de la familia Taeniidae— indican alimentación de los perros con vísceras de ganado y la ausencia de tratamiento tenicida, lo que permite estimar el riesgo sanitario que esta práctica implica, especialmente para los niños de la región, por posible infección con Echinococcus spp.
- DESCRIPCIÓN DE LOS MÉTODOS A UTILIZAR
Método de flotación de Willis
El método de Willis se basa en la flotación de los huevos de parásitos en una solución con alta densidad (mayor que la de los huevos), lo que permite que asciendan a la superficie y puedan ser recogidos y observados.
Generalmente se usa solución saturada de cloruro de sodio (NaCl) con densidad ≈ 1,20.
Posible de realizar en laboratorio de baja complejidad.
Ideal para la detección cualitativa de huevos livianos (p. ej., Toxocara, Ancylostoma, Ascaris).
Los huevos de Taenia pueden no flotar y pasar desapercibidos.
La solución salina puede distorsionar o cristalizar los huevos si se demora la observación.
Materiales y reactivos
– Solución saturada de cloruro de sodio (NaCl).
– Tubos de ensayo o frascos de boca estrecha.
– Gasa o tamiz fino.
– Cubreobjetos y portaobjetos.
– Pipeta Pasteur.
– Microscopio óptico.
Método resumido
- Tomar 5 mL del homogenizado y mezclar con 5 mL de solución de Willis (NaCl saturado, densidad ~1,20).
- Filtrar por gasa doble a un tubo de centrífuga.
- Completar con la solución hasta el borde, formando un menisco convexo.
- Colocar un cubreobjeto sobre la boca del tubo y dejar reposar 10 min.
- Levantar el cubreobjeto con cuidado y colocarlo sobre un portaobjeto.
- Observar inmediatamente (se seca rápido) con 10X y 40X.
- Examinar al menos tres portaobjetos.
Método de sedimentación de Telemann (modificado)
El método de Telemann se basa en la sedimentación y concentración de huevos por su peso específico, usando una solución con formol y cloruro de sodio que fija y limpia la muestra.
Se lo denomina modificado cuando se incorpora éter (o centrifugación), lo que mejora la recuperación.
Posible de realizar en laboratorio de baja complejidad.
Materiales y reactivos
Solución de Telemann:
- Cloruro de sodio: 5 g
- Formol al 40 %: 50 mL
- Agua destilada: 950 mL
Otros: tubos de centrífuga; gasa o tamiz fino; éter (opcional, como paso de limpieza); pipeta Pasteur; porta y cubreobjetos; centrífuga; microscopio.
Procedimiento resumido
- Mezclar la muestra con solución de Telemann en un mortero, triturando bien con el pilón.
- Filtrar por gasa doble a un tubo de centrífuga, llenándolo hasta las ¾ partes.
- Agregar 1 mL de éter y mezclar bien (precaución: puede salpicar). Si las heces son poco grasosas, usar 0,5 mL de éter. (Por costos, se menciona el uso de 2 mL de quitaesmalte –acetona–; no es el estándar, pero puede emplearse en contextos con recursos limitados y buena ventilación).
- Centrifugar a 1500 rpm durante 3 minutos
- Descartar las capas superiores y conservar el sedimento (pellet). Tomar con pipeta Pasteur, colocar en portaobjeto.
- Añadir una gota de lugol para facilitar la observación.
- Observar con 10X y 40X; al menos tres portaobjetos por muestra.
Técnica de sedimentación de Ritchie (formol–éter)
La técnica de Ritchie se basa en la concentración por sedimentación: los huevos —más pesados que los restos fecales y los solventes— se depositan en el fondo del tubo tras la centrifugación.
El formol fija y conserva los parásitos, mientras que el éter (o acetato de etilo) disuelve las grasas y detritos, aclarando la muestra.
Más sensible para Taenia y produce sedimentos limpios.
Requiere laboratorio con buena ventilación o campana.
Materiales y reactivos
– Solución de formol al 10 % (fijador).
– Éter etílico o acetato de etilo (extractor de grasas).
– Tubos de centrífuga con tapa.
– Gasa o tamiz fino.
– Pipeta Pasteur.
– Porta y cubreobjetos.
– Centrífuga.
– Microscopio óptico.
Procedimiento resumido
- Tomar 5 mL del homogenizado y mezclar con 5 mL de formol al 10 % hasta obtener una suspensión.
- Filtrar por gasa a otro tubo para eliminar partículas gruesas.
- Agregar 3–4 mL de éter o acetato de etilo. Tapar y agitar vigorosamente (cuidado: puede generar presión).
- Centrifugar a ≈ 1500 rpm durante 2–3 min.
- Decantar: se forman cuatro capas
- – Superior: éter
– Segunda: tapón graso
– Tercera: formol
– Fondo: sedimento con parásitos
- Descartar cuidadosamente las tres capas superiores.
- Examen microscópico: con pipeta Pasteur, tomar una gota del sedimento, colocarla en porta, añadir lugol y cubrir con cubreobjeto.
- Observar a 10X y 40X.
Recomendaciones para las observaciones microscópicas
Se sugiere buscar Taenia en los lugares de faena y sembrar múltiples muestras, hasta conocer las técnicas y “entrenar el ojo” para reconocer los huevos.
- La lectura debe ser ordenada y sistemática, abarcando toda la preparación; que los recorridos se superpongan ligeramente para no dejar áreas sin examinar.
- Observar al menos tres portaobjetos por muestra analizada.
- Aunque un buen método de recuperación aumenta la sensibilidad, lo más importante es la experiencia del observador y el conocimiento morfológico de las formas parasitarias.
- Cuando se trabaja con éter, tener en cuenta que es inflamable y volátil. Buena ventilación y medidas de bioseguridad.
- El resultado final será la integración de los tres métodos utilizados.